Assay voor het bepalen van de activiteit van een remmer tegen stollingsfactor VIII

Ook wel bekend als Bethesda-assay (zie voor verdere uitleg hieronder).

Bij een verlaagde FVIII-activiteit kan er sprake zijn van een remmer van de activiteit van stollingsfactor VIII, meestal veroorzaakt door een antistof.
Met de FVIII-remmer assay kan de aanwezigheid en mate van remming door een dergelijke antistof gedetecteerd worden.

Deze test wordt aangevraagd bij:

• patiënten met aangeboren hemofilie A (monitoring) die een onverwachte daling van spiegel hebben. (type I remmer = allo-antistof)1
• bij patiënten met (verdenking op) verworven hemofilie A (diagnose en monitoring). (type II remmer = auto-antistof)1

De FVIII-remmer assay meet de hoeveelheid remming van FVIII activiteit na een incubatiestap bij 37°C.

• In de remmer assay wordt gebruik gemaakt van verschil in hittegevoeligheid van de stollingsfactoren en de FVIII-remmer. Het patiëntplasma wordt tot 58°C verwarmd, de temperatuur waarbij stollingsfactoren in het patiëntplasma inactief worden, maar eventueel aanwezige remmers intact blijven.
• Om te corrigeren voor het effect van de verwarming op andere factoren wordt naast het patiëntplasma een controleplasma meegenomen in alle stappen van de assay: een FVIII-deficiënt plasma, waarin geen FVIII aanwezig is, maar well alle andere stollingsfactoren.
• Na verhitting wordt het patiëntplasma (en controleplasma) 1:1 gemengd met een bekende hoeveelheid plasma van gezonde personen waarin een bekende hoeveelheid FVIII aanwezig is (evenals een normale hoeveelheid van andere stollingsfactoren).
• Het mengsel wordt verwarmd bij 37°C en geïncubeerd gedurende 2 uur: in deze tijd kan een eventuele remmer het aanwezige FVIII inactiveren.
• Na de incubatiestap wordt de (resterende) FVIII-activiteit gemeten met een FVIII-assay (chromogene assay of one-stage activiteitsassay).

• Bij aanwezigheid van een remmer is de FVIII-activiteit in het mengsel met patiëntplasma beduidend lager dan de FVIII-activiteit in het mengsel met controleplasma.
• De mate van remmer-activiteit, oftewel de mate van inactivatie van FVIII wordt uitgedrukt in de Bethesda Unit, BU:
  
  1 BU = de hoeveelheid remmer die leidt tot een 50% vermindering van FVIII-activiteit. Deze 50% vermindering treedt op in een 1:1 mengsel van controleplasma met FVIII gedepleteerd patiëntplasma in vergelijking met een 1:1 mengsel van controleplasma met een FVIII-gedepleteerd controleplasma waarin bewezen geen remmer aanwezig is.

In gezonde personen is geen remmer-activiteit detecteerbaar:
de uitslag wordt dan gerapporteerd als lager dan het meetbereik (bijvoorbeeld < 0.5 (N)BU).

De originele Bethesda-assay is opgesteld in de jaren 70 tijdens een bijeenkomst van hematologen in Bethesda, Maryland in de VS². 
Deze originele assay bleek gevoelig voor variaties in pH, waardoor de assay minder goed kan meten in het lage gebied en eventueel kan leiden tot vals-positieve uitslagen. Om de performance van de test in het lage gebied te verbeteren heeft een groep van wetenschappers van het universiteitsziekenhuis St. Radboud in Nijmegen (huidige Radboudumc) het assayprotocol aangepast³. Dit aangepaste protocol staat bekend als de 'Nijmegen modificatie van de Bethesda-assay' of kortgezegd de Nijmegen-Bethesda-assay.
Naast de Nijmegen modificatie zijn er nog andere, minder gebruikte, variaties op de Bethesda-assay bekend.

De Nederlandse richtlijn⁴ voor Hemofilie van de Nederlandse Vereniging voor Hematologie (NVvH) uit 2022 beveelt aan de FVIII-remmer activiteit te laten bepalen en kwantificeren met de Nijmegen-Bethesda-assay.

In Nederland en België wordt ernaar gestreefd deze assay (verder) te harmoniseren tussen alle verschillende laboratoria. Met dat doeleinde is in 2020 door een consortium van laboratoriumspecialisten van hemofiliebehandelcentra in Nederland en België een geharmoniseerd protocol gepubliceerd⁵.

Emicizumab (merknaam Hemlibra) wordt gebruikt als profylactische behandeling bij patiënten met ernstige aangeboren hemofilie A. Dit middel grijpt aan op humane stollingsfactor IX en X, zoals ook geactiveerd FVIII dat doet.
Aanwezigheid van dit middel in het bloed van een hemofiliepatiënt stoort in assays die FVIII-activiteit meten middels humane stollingsfactoren. Voor detectie van FVIII-activiteit in plasma van patiënten behandeld met emicizumab moet daarom niet een humane chromogene FVIII-assay gebruikt worden, maar een bovine chromogene FVIII-assay.